Hoe leest u een CoA en een chromatogram?

Wat is een certificate of analysis (CoA)

Een certificate of analysis, afgekort CoA, is een analysedocument dat bij een specifieke batch van een stof hoort en de resultaten van laboratoriumtesten weergeeft. Een CoA voor een peptide bevat doorgaans minimaal twee soorten analyses: een HPLC-analyse voor de bepaling van zuiverheid en een massaspectrometrie-analyse (MS) voor de bevestiging van het molecuulgewicht. Daarnaast vermeldt het document meestal het batchnummer, de testdatum en de gebruikte analysemethode.

Het chromatogram lezen: retentietijd en hoofdpiek

Een HPLC-chromatogram toont op de horizontale as de tijd, uitgedrukt in minuten, en op de verticale as de signaalintensiteit die door de detector wordt gemeten. Wanneer een stof door de kolom stroomt, bereikt deze de detector na een bepaalde retentietijd, die kenmerkend is voor die stof onder de gebruikte analysecondities. Dit resulteert in een piek op het chromatogram. De grootste piek, die het overgrote deel van de oppervlakte inneemt, wordt de hoofdpiek genoemd en vertegenwoordigt de hoofdcomponent van het monster.

Oppervlaktepercentage en nevenpieken

Naast de hoofdpiek kunnen kleinere pieken zichtbaar zijn op andere retentietijden. Deze nevenpieken vertegenwoordigen verwante stoffen of onzuiverheden in lagere concentratie. Software berekent voor elke piek de oppervlakte en drukt deze uit als percentage van de totale oppervlakte van alle pieken samen. Dit oppervlaktepercentage van de hoofdpiek is het zuiverheidspercentage dat op een CoA wordt vermeld. Hoe kleiner en minder talrijk de nevenpieken, hoe hoger het gerapporteerde zuiverheidspercentage.

Massaspectrometrie: bevestiging van het molecuulgewicht

Naast de HPLC-analyse bevat een volledig CoA een resultaat van massaspectrometrie. Bij deze techniek worden moleculen geioniseerd en gescheiden op basis van hun massa-ladingverhouding. Het resultaat is een gemeten molecuulgewicht dat wordt vergeleken met het theoretisch berekende molecuulgewicht van de beoogde peptidesequentie. Een overeenkomst tussen gemeten en verwachte massa bevestigt de identiteit van de stof. Zonder deze MS-bevestiging geeft een HPLC-resultaat alleen inzicht in de zuiverheid, niet in de vraag of de hoofdcomponent daadwerkelijk de beoogde peptidesequentie betreft.

Een CoA in de praktijk beoordelen

Bij het beoordelen van een CoA is het van belang om te controleren of het batchnummer overeenkomt met de ontvangen stof, of zowel een HPLC- als een MS-resultaat aanwezig zijn, en of de gerapporteerde retentietijd en het molecuulgewicht consistent zijn met de beoogde stof. Een chromatogram met een enkele scherpe hoofdpiek en minimale nevenpieken, gecombineerd met een MS-resultaat dat overeenkomt met het verwachte molecuulgewicht, vormt samen de basis voor een goed gedocumenteerde analyse.