Jak czytać CoA i chromatogram
Odczytywanie certyfikatu analizy i chromatogramu HPLC: pik, czas retencji i czystość w procentach.
Czym jest certyfikat analizy (CoA)
Certyfikat analizy, w skrócie CoA, to dokument analityczny powiązany z konkretną partią substancji, przedstawiający wyniki testów laboratoryjnych. CoA dla peptydu zazwyczaj zawiera co najmniej dwa rodzaje analiz: analizę HPLC służącą do oznaczenia czystości oraz analizę spektrometrii mas (MS) potwierdzającą masę cząsteczkową. Dokument zwykle podaje również numer partii, datę testu oraz zastosowaną metodę analityczną.
Odczytywanie chromatogramu: czas retencji i główny pik
Chromatogram HPLC przedstawia na osi poziomej czas wyrażony w minutach, a na osi pionowej intensywność sygnału zmierzoną przez detektor. Gdy substancja przepływa przez kolumnę, dociera do detektora po określonym czasie retencji, charakterystycznym dla tej substancji w danych warunkach analitycznych. Powoduje to powstanie piku na chromatogramie. Największy pik, zajmujący największą część powierzchni, nazywany jest głównym pikiem i reprezentuje główny składnik próbki.
Procentowy udział powierzchni piku i piki dodatkowe
Obok głównego piku mogą pojawić się mniejsze piki przy innych czasach retencji. Te piki dodatkowe reprezentują substancje pokrewne lub zanieczyszczenia obecne w niższych stężeniach. Oprogramowanie oblicza powierzchnię każdego piku i wyraża ją jako procent całkowitej powierzchni wszystkich pików łącznie. Procentowy udział powierzchni głównego piku to procent czystości podawany na CoA. Im mniejsze i mniej liczne piki dodatkowe, tym wyższy podawany procent czystości.
Spektrometria mas: potwierdzenie masy cząsteczkowej
Oprócz analizy HPLC pełny CoA zawiera wynik spektrometrii mas. W tej technice cząsteczki są jonizowane i rozdzielane na podstawie stosunku masy do ładunku. Wynikiem jest zmierzona masa cząsteczkowa, którą porównuje się z teoretycznie obliczoną masą cząsteczkową zamierzonej sekwencji peptydowej. Zgodność między masą zmierzoną a oczekiwaną potwierdza tożsamość substancji. Bez tego potwierdzenia MS wynik HPLC daje wgląd wyłącznie w czystość, a nie w to, czy główny składnik rzeczywiście odpowiada zamierzonej sekwencji peptydowej.
Ocena CoA w praktyce
Przy ocenie CoA istotne jest sprawdzenie, czy numer partii odpowiada otrzymanej substancji, czy obecne są zarówno wynik HPLC, jak i wynik MS, oraz czy podany czas retencji i masa cząsteczkowa są zgodne z zamierzoną substancją. Chromatogram z pojedynczym, ostrym głównym pikiem i minimalnymi pikami dodatkowymi, w połączeniu z wynikiem MS zgodnym z oczekiwaną masą cząsteczkową, stanowią razem podstawę dobrze udokumentowanej analizy.