Comment lire un CoA et un chromatogramme ?

Qu'est-ce qu'un certificate of analysis (CoA)

Un certificate of analysis, abrégé CoA, est un document analytique associé à un lot spécifique d'une substance et présentant les résultats des tests de laboratoire. Un CoA pour un peptide comprend généralement au moins deux types d'analyses : une analyse HPLC pour la détermination de la pureté et une analyse par spectrométrie de masse (MS) pour la confirmation du poids moléculaire. Le document mentionne également, en général, le numéro de lot, la date du test et la méthode d'analyse utilisée.

Lire le chromatogramme : temps de rétention et pic principal

Un chromatogramme HPLC affiche le temps, exprimé en minutes, sur l'axe horizontal, et l'intensité du signal mesurée par le détecteur sur l'axe vertical. Lorsqu'une substance traverse la colonne, elle atteint le détecteur après un temps de rétention spécifique, caractéristique de cette substance dans les conditions d'analyse utilisées. Cela produit un pic sur le chromatogramme. Le pic le plus grand, occupant la plus grande part de la surface, est appelé pic principal et représente le composant principal de l'échantillon.

Pourcentage de surface et pics secondaires

Outre le pic principal, des pics plus petits peuvent apparaître à d'autres temps de rétention. Ces pics secondaires représentent des substances apparentées ou des impuretés présentes à des concentrations plus faibles. Le logiciel calcule la surface de chaque pic et l'exprime en pourcentage de la surface totale de l'ensemble des pics. Ce pourcentage de surface du pic principal correspond au pourcentage de pureté indiqué sur un CoA. Plus les pics secondaires sont petits et peu nombreux, plus le pourcentage de pureté rapporté est élevé.

Spectrométrie de masse : confirmation du poids moléculaire

Outre l'analyse HPLC, un CoA complet comprend un résultat de spectrométrie de masse. Dans cette technique, les molécules sont ionisées puis séparées selon leur rapport masse sur charge. Le résultat est un poids moléculaire mesuré, comparé au poids moléculaire théoriquement calculé pour la séquence peptidique visée. Une correspondance entre la masse mesurée et la masse attendue confirme l'identité de la substance. Sans cette confirmation par MS, un résultat HPLC ne renseigne que sur la pureté, et non sur le fait que le composant principal corresponde réellement à la séquence peptidique visée.

Évaluer un CoA en pratique

Lors de l'évaluation d'un CoA, il est important de vérifier que le numéro de lot correspond à la substance reçue, qu'un résultat HPLC et un résultat MS sont tous deux présents, et que le temps de rétention et le poids moléculaire rapportés sont cohérents avec la substance visée. Un chromatogramme présentant un pic principal unique et net, avec des pics secondaires minimaux, associé à un résultat MS correspondant au poids moléculaire attendu, constitue ensemble la base d'une analyse bien documentée.