Come leggere un CoA e un cromatogramma

Cos'è un certificato di analisi (CoA)

Un certificato di analisi, abbreviato CoA, è un documento analitico associato a un lotto specifico di una sostanza, che presenta i risultati dei test di laboratorio. Un CoA per un peptide contiene tipicamente almeno due tipi di analisi: un'analisi HPLC per la determinazione della purezza e un'analisi di spettrometria di massa (MS) per la conferma del peso molecolare. Il documento riporta generalmente anche il numero di lotto, la data del test e il metodo analitico utilizzato.

Leggere il cromatogramma: tempo di ritenzione e picco principale

Un cromatogramma HPLC mostra il tempo, espresso in minuti, sull'asse orizzontale, e l'intensità del segnale misurata dal rivelatore sull'asse verticale. Quando una sostanza scorre attraverso la colonna, raggiunge il rivelatore dopo un tempo di ritenzione specifico, caratteristico di quella sostanza nelle condizioni analitiche utilizzate. Questo produce un picco nel cromatogramma. Il picco più grande, che occupa la quota maggiore dell'area, è chiamato picco principale e rappresenta il componente principale del campione.

Percentuale dell'area di picco e picchi secondari

Accanto al picco principale possono comparire picchi più piccoli ad altri tempi di ritenzione. Questi picchi secondari rappresentano sostanze correlate o impurità presenti a concentrazioni inferiori. Il software calcola l'area di ciascun picco e la esprime come percentuale dell'area totale di tutti i picchi combinati. La percentuale dell'area del picco principale è la percentuale di purezza indicata su un CoA. Quanto più piccoli e meno numerosi sono i picchi secondari, tanto più alta risulta la percentuale di purezza dichiarata.

Spettrometria di massa: conferma del peso molecolare

Oltre all'analisi HPLC, un CoA completo include un risultato di spettrometria di massa. In questa tecnica, le molecole vengono ionizzate e separate in base al rapporto massa su carica. Il risultato è un peso molecolare misurato, che viene confrontato con il peso molecolare calcolato teoricamente per la sequenza peptidica prevista. Una corrispondenza tra la massa misurata e quella attesa conferma l'identità della sostanza. Senza questa conferma MS, un risultato HPLC fornisce indicazioni solo sulla purezza, non sul fatto che il componente principale corrisponda effettivamente alla sequenza peptidica prevista.

Valutare un CoA nella pratica

Nella valutazione di un CoA, è importante verificare che il numero di lotto corrisponda alla sostanza ricevuta, che siano presenti sia un risultato HPLC sia un risultato MS, e che il tempo di ritenzione e il peso molecolare dichiarati siano coerenti con la sostanza prevista. Un cromatogramma con un unico picco principale netto e picchi secondari minimi, unito a un risultato MS corrispondente al peso molecolare atteso, costituisce nel complesso la base di un'analisi ben documentata.