Wie liest man ein CoA und ein Chromatogramm?

Was ist ein Certificate of Analysis (CoA)

Ein Certificate of Analysis, abgekürzt CoA, ist ein Analysedokument, das zu einer bestimmten Charge einer Substanz gehört und die Ergebnisse von Laboruntersuchungen darstellt. Ein CoA für ein Peptid enthält in der Regel mindestens zwei Arten von Analysen: eine HPLC-Analyse zur Bestimmung der Reinheit und eine Massenspektrometrie-Analyse (MS) zur Bestätigung des Molekulargewichts. Zusätzlich enthält das Dokument meist die Chargennummer, das Testdatum und die verwendete Analysemethode.

Das Chromatogramm lesen: Retentionszeit und Hauptpeak

Ein HPLC-Chromatogramm zeigt auf der horizontalen Achse die Zeit in Minuten und auf der vertikalen Achse die vom Detektor gemessene Signalintensität. Wenn eine Substanz die Säule durchläuft, erreicht sie den Detektor nach einer bestimmten Retentionszeit, die für diese Substanz unter den verwendeten Analysebedingungen charakteristisch ist. Dies führt zu einem Peak im Chromatogramm. Der größte Peak, der den überwiegenden Teil der Fläche einnimmt, wird als Hauptpeak bezeichnet und repräsentiert die Hauptkomponente der Probe.

Flächenanteil und Nebenpeaks

Neben dem Hauptpeak können kleinere Peaks bei anderen Retentionszeiten sichtbar sein. Diese Nebenpeaks repräsentieren verwandte Substanzen oder Verunreinigungen in geringerer Konzentration. Die Software berechnet für jeden Peak die Fläche und drückt diese als Prozentsatz der Gesamtfläche aller Peaks zusammen aus. Dieser Flächenanteil des Hauptpeaks ist der Reinheitswert, der auf einem CoA angegeben wird. Je kleiner und weniger zahlreich die Nebenpeaks sind, desto höher ist der angegebene Reinheitswert.

Massenspektrometrie: Bestätigung des Molekulargewichts

Neben der HPLC-Analyse enthält ein vollständiges CoA ein Ergebnis der Massenspektrometrie. Bei dieser Technik werden Moleküle ionisiert und anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses getrennt. Das Ergebnis ist ein gemessenes Molekulargewicht, das mit dem theoretisch berechneten Molekulargewicht der beabsichtigten Peptidsequenz verglichen wird. Eine Übereinstimmung zwischen gemessener und erwarteter Masse bestätigt die Identität der Substanz. Ohne diese MS-Bestätigung liefert ein HPLC-Ergebnis nur Erkenntnisse über die Reinheit, nicht aber darüber, ob die Hauptkomponente tatsächlich der beabsichtigten Peptidsequenz entspricht.

Ein CoA in der Praxis beurteilen

Bei der Beurteilung eines CoA ist es wichtig zu prüfen, ob die Chargennummer mit der erhaltenen Substanz übereinstimmt, ob sowohl ein HPLC- als auch ein MS-Ergebnis vorhanden sind, und ob die angegebene Retentionszeit und das Molekulargewicht mit der beabsichtigten Substanz übereinstimmen. Ein Chromatogramm mit einem einzelnen scharfen Hauptpeak und minimalen Nebenpeaks, kombiniert mit einem MS-Ergebnis, das dem erwarteten Molekulargewicht entspricht, bildet zusammen die Grundlage für eine gut dokumentierte Analyse.