Hoe peptiden worden gemaakt (SPPS)

Waarom een vaste drager het probleem oplost

Een peptide is een keten van aminozuren in een precieze volgorde. Die keten met de hand in een oplossing bouwen is lastig, want na elke koppeling moet het tussenproduct worden gescheiden van de resten reagens. Dat kost bij elke stap tijd en verlies. De doorbraak van SPPS was een simpel idee: zet het groeiende peptide vast aan een onoplosbaar bolletje, een hars. Dan zijn de overtollige reagentia gewoon weg te spoelen, terwijl het peptide blijft zitten.

Robert Bruce Merrifield bedacht deze aanpak, waarvoor hij in 1984 de Nobelprijs voor de Scheikunde kreeg. Sindsdien is SPPS de standaardmethode voor het maken van peptiden in laboratoria. Het maakte het proces betrouwbaar genoeg om te automatiseren met machines.

De herhaalde cyclus stap voor stap

SPPS is een lus die zo vaak wordt herhaald als er aminozuren zijn. Elk aminozuur komt in het proces binnen met een tijdelijke beschermkap op zijn koppelbare uiteinde, zodat het niet op het verkeerde moment reageert. De cyclus heeft twee kernstappen die elkaar afwisselen.

Eerst de ontscherming, waarbij de beschermkap van het bovenste aminozuur van de keten wordt verwijderd, zodat er een vrij uiteinde ontstaat. Dan de koppeling, waarbij het volgende aminozuur, geactiveerd met een hulpstof, aan dat vrije uiteinde wordt vastgemaakt. Daarna spoelt men alles schoon en begint de cyclus opnieuw voor het volgende aminozuur.

Bescherming en activering

Het geheim van een schone synthese zit in bescherming. Aminozuren hebben meerdere plekken die kunnen reageren, en het doel is om maar op een plek tegelijk te koppelen. Daarom draagt elk aminozuur beschermgroepen op de plekken die met rust moeten blijven. De meest gebruikte strategie heet Fmoc, genoemd naar de beschermgroep die na elke stap wordt verwijderd.

Activering is de andere helft. Een aminozuur koppelt niet vanzelf snel genoeg, dus wordt zijn koppelbare kant chemisch geprikkeld met een activeringsreagens. Dat versnelt de reactie en zorgt dat de koppeling in hoge mate slaagt. Hoe hoger het slagingspercentage per stap, hoe zuiverder het eindproduct.

Losmaken en zuiveren

Als de volledige volgorde is opgebouwd, moet het peptide van de hars af en moeten alle blijvende beschermgroepen eraf. Dat gebeurt in een klievingsstap, vaak met een sterk zuur. Wat overblijft is het ruwe peptide, een mengsel van het gewenste product en kleine hoeveelheden bijproducten die tijdens de vele stappen zijn ontstaan.

Daarna volgt zuivering, meestal met HPLC. Die scheidt het gewenste peptide van de bijproducten. Na de zuivering wordt het peptide gecontroleerd, onder meer met massaspectrometrie om het molecuulgewicht te bevestigen en met HPLC om de zuiverheid te meten. Die uitslagen komen op het certificaat van analyse.

Grenzen en langere ketens

SPPS werkt uitstekend voor korte tot middellange ketens. Bij elke koppeling gaat een heel klein beetje verloren, en die verliezen stapelen op. Voor zeer lange peptiden of eiwitten wordt de opbrengst daardoor lager en het zuiveren moeilijker. Voor die gevallen bestaan andere routes, zoals het aan elkaar koppelen van kortere stukken of biologische productie met cellen.

Voor de meeste onderzoekspeptiden op de markt blijft SPPS echter de werkpaardmethode. Het is voorspelbaar, goed te automatiseren en levert materiaal waarvan de identiteit met standaardtesten te bevestigen is.