Come si producono i peptidi (SPPS)

Perché un supporto solido risolve il problema

Un peptide è una catena di amminoacidi in un ordine preciso. Costruire quella catena a mano in una soluzione è difficile, perché dopo ogni accoppiamento occorre separare il prodotto intermedio dai resti di reagente. Ciò costa tempo e perdita a ogni passaggio. La svolta della SPPS è stata un'idea semplice: fissare il peptide in crescita a una sfera insolubile, una resina. Allora si possono semplicemente sciacquare via i reagenti in eccesso, mentre il peptide resta al suo posto.

Robert Bruce Merrifield ideò questo approccio, per il quale ricevette nel 1984 il Premio Nobel per la Chimica. Da allora la SPPS è il metodo standard per produrre peptidi nei laboratori. Rese il processo abbastanza affidabile da poter essere automatizzato con macchine.

Il ciclo ripetuto passo dopo passo

La SPPS è un ciclo che si ripete tante volte quanti sono gli amminoacidi. Ogni amminoacido entra nel processo con un cappuccio protettivo temporaneo sulla sua estremità accoppiabile, così da non reagire nel momento sbagliato. Il ciclo ha due passaggi centrali che si alternano.

Prima la deprotezione, in cui il cappuccio protettivo viene rimosso dall'amminoacido in cima alla catena, così che si forma un'estremità libera. Poi l'accoppiamento, in cui l'amminoacido successivo, attivato con una sostanza ausiliaria, viene fissato a quell'estremità libera. Dopodiché si sciacqua tutto e il ciclo ricomincia per l'amminoacido successivo.

Protezione e attivazione

Il segreto di una sintesi pulita risiede nella protezione. Gli amminoacidi hanno più punti che possono reagire, e si vuole accoppiare in un solo punto per volta. Perciò ogni amminoacido porta gruppi protettivi sui punti che devono restare intatti. La strategia più usata si chiama Fmoc, dal nome del gruppo protettivo che viene rimosso dopo ogni passaggio.

L'attivazione è l'altra metà. Un amminoacido non si accoppia da solo abbastanza in fretta, perciò il suo lato accoppiabile viene stimolato chimicamente con un reagente di attivazione. Ciò accelera la reazione e fa sì che l'accoppiamento riesca in larga misura. Più alto è il tasso di successo per passaggio, più puro è il prodotto finale.

Staccare e purificare

Una volta costruita l'intera sequenza, il peptide deve essere tolto dalla resina e tutti i gruppi protettivi permanenti devono essere rimossi. Ciò avviene in un passaggio di scissione, spesso con un acido forte. Ciò che resta è il peptide grezzo, una miscela del prodotto desiderato e di piccole quantità di sottoprodotti formatisi durante i molti passaggi.

Segue poi la purificazione, di solito con HPLC. Questa separa il peptide desiderato dai sottoprodotti. Dopo la purificazione il peptide viene controllato, tra l'altro con spettrometria di massa per confermare il peso molecolare e con HPLC per misurare la purezza. Questi esiti figurano sul certificato di analisi.

Limiti e catene più lunghe

La SPPS funziona in modo eccellente per catene corte e medie. A ogni accoppiamento si perde una quantità piccolissima, e quelle perdite si accumulano. Per peptidi o proteine molto lunghi la resa diminuisce perciò e la purificazione diventa più difficile. Per quei casi esistono altre vie, come l'accoppiamento tra loro di pezzi più corti o la produzione biologica con cellule.

Per la maggior parte dei peptidi di ricerca sul mercato, tuttavia, la SPPS resta il metodo cavallo di battaglia. È prevedibile, facile da automatizzare e fornisce materiale la cui identità può essere confermata con test standard.