Spettrometria di massa: misurare il peso molecolare

L'idea di base: pesare caricando

Non si può posare una singola molecola su una comune bilancia. La spettrometria di massa lo risolve con una deviazione ingegnosa. La molecola riceve prima una carica elettrica, poi viene inviata attraverso un campo. Quanto è pesante una particella carica determina con quale forza viene deviata da quel campo o con quale velocità si muove. Da quel movimento l'apparecchio ricalcola la massa.

Ciò che uno spettrometro di massa misura in realtà non è la massa da sola, ma il rapporto tra massa e carica. Questo rapporto si chiama valore m/z. Dal valore m/z e dal numero di cariche si deduce il peso molecolare. Il risultato è uno spettro: un grafico con picchi, in cui ogni picco rappresenta una particella di una determinata massa.

I tre passaggi in ogni apparecchio

Ogni spettrometro di massa lavora in tre passaggi. Prima la ionizzazione, in cui la molecola riceve una carica. Per i peptidi si usano spesso metodi dolci che lasciano la molecola intatta, come la ionizzazione electrospray o il MALDI. Dolce significa qui che il peptide non si spezza in pezzi durante la carica.

Poi la separazione, in cui le particelle cariche vengono ordinate per massa nell'analizzatore. E infine la rilevazione, in cui un sensore conta quante particelle di ciascuna massa arrivano. Quel conteggio diventa lo spettro. L'altezza di un picco dice qualcosa su quanta di quella particella fosse presente.

Che cosa rivela su un peptide

Un peptide ha una sequenza di amminoacidi nota, e da quella sequenza si può sommare il peso molecolare atteso. La spettrometria di massa misura il peso reale. Se il valore misurato corrisponde al valore calcolato, è una prova solida che la molecola giusta si trova nella provetta. Se differisce, qualcosa non va: una sequenza sbagliata, un pezzo mancante o una modifica indesiderata della molecola.

Gli apparecchi moderni misurano con tale precisione da poter vedere la differenza di un singolo atomo di idrogeno. Perciò rivelano anche piccole modifiche, come un'ossidazione o un amminoacido legato in modo errato. Ciò rende il metodo un controllo minuzioso dell'identità e della purezza di un peptide.

La collaborazione con la HPLC

La spettrometria di massa viene spesso accoppiata alla HPLC, una tecnica che prima separa una miscela in componenti singoli. La combinazione si chiama LC-MS. La HPLC separa le sostanze nel tempo, così che entrano una a una nello spettrometro di massa. In questo modo si ottiene per ogni componente una misurazione di massa propria.

Questo accoppiamento è utile perché un campione è raramente del tutto puro. Con la LC-MS si vede non solo il prodotto principale, ma anche gli eventuali sottoprodotti e la loro massa. Offre dunque un quadro più completo di ciascuna delle due tecniche da sola.

Limiti del metodo

La spettrometria di massa indica la massa, ma non direttamente la forma tridimensionale di una molecola. Due molecole con la stessa composizione atomica possono avere la stessa massa e tuttavia essere ripiegate in modo diverso. La misurazione non dice nulla nemmeno sull'attività biologica. Conferma l'identità molecolare, non la funzione né la sicurezza.

Per un quadro completo, i laboratori combinano perciò la misurazione di massa con altri test, come la HPLC per la purezza e talvolta analisi aggiuntive per la struttura. Insieme formano il pacchetto di analisi che figura su un certificato di analisi.