Spektrometria mas: pomiar masy cząsteczkowej

Podstawowa idea: ważenie przez naładowanie

Nie da się położyć pojedynczej cząsteczki na zwykłej wadze. Spektrometria mas rozwiązuje to sprytnym obejściem. Cząsteczka najpierw otrzymuje ładunek elektryczny, a następnie zostaje wysłana przez pole. To, jak ciężka jest naładowana cząstka, decyduje o tym, jak mocno zostanie odchylona przez to pole albo jak szybko się porusza. Z tego ruchu urządzenie oblicza masę wstecz.

To, co spektrometr mas naprawdę mierzy, to nie sama masa, lecz stosunek masy do ładunku. Ten stosunek nazywa się wartością m/z. Z wartości m/z i liczby ładunków wyprowadza się masę cząsteczkową. Wynikiem jest widmo: wykres z pikami, gdzie każdy pik reprezentuje cząstkę o określonej masie.

Trzy etapy w każdym urządzeniu

Każdy spektrometr mas działa w trzech etapach. Najpierw jonizacja, podczas której cząsteczka otrzymuje ładunek. W przypadku peptydów często stosuje się metody miękkie, które zachowują cząsteczkę w całości, takie jak jonizacja przez elektrorozpylanie lub MALDI. Miękka oznacza tutaj, że peptyd nie rozpada się na kawałki podczas naładowywania.

Następnie rozdzielanie, podczas którego naładowane cząstki są sortowane według masy w analizatorze. I na koniec detekcja, podczas której czujnik zlicza, ile cząstek o każdej masie dociera. To zliczanie staje się widmem. Wysokość piku mówi coś o tym, jak dużo danej cząstki było obecne.

Co mówi o peptydzie

Peptyd ma znaną sekwencję aminokwasową, a z tej sekwencji można zsumować oczekiwaną masę cząsteczkową. Spektrometria mas mierzy rzeczywistą masę. Jeśli zmierzona wartość zgadza się z obliczoną, jest to mocny dowód, że w probówce znajduje się właściwa cząsteczka. Jeśli się różni, coś jest nie tak: błędna sekwencja, brakujący fragment albo niepożądana zmiana cząsteczki.

Nowoczesne urządzenia mierzą tak dokładnie, że potrafią dostrzec różnicę pojedynczego atomu wodoru. Dzięki temu ujawniają też niewielkie zmiany, takie jak utlenienie lub błędnie połączony aminokwas. To czyni tę metodę drobiazgową kontrolą tożsamości i czystości peptydu.

Współpraca z HPLC

Spektrometrię mas często łączy się z HPLC, techniką, która najpierw rozdziela mieszaninę na poszczególne składniki. Połączenie nazywa się LC-MS. HPLC rozdziela substancje w czasie, tak że wchodzą one do spektrometru mas jedna po drugiej. Dzięki temu otrzymuje się osobny pomiar masy dla każdego składnika.

To połączenie jest przydatne, ponieważ próbka rzadko bywa całkowicie czysta. Za pomocą LC-MS widać nie tylko główny produkt, ale też ewentualne produkty uboczne i ich masę. Daje to więc pełniejszy obraz niż każda z technik z osobna.

Granice metody

Spektrometria mas podaje masę, ale nie bezpośrednio trójwymiarowy kształt cząsteczki. Dwie cząsteczki o tym samym składzie atomowym mogą mieć tę samą masę, a mimo to być inaczej zwinięte. Pomiar nie mówi też nic o działaniu biologicznym. Potwierdza tożsamość molekularną, a nie funkcję czy bezpieczeństwo.

Aby uzyskać pełny obraz, laboratoria łączą więc pomiar masy z innymi testami, takimi jak HPLC do oceny czystości, a czasem dodatkowymi analizami struktury. Razem tworzą one pakiet analityczny na certyfikacie analizy.